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熱啟動PCR常用于增強PCR擴增的特異性。熱啟動PCR主要借助一種酶的修飾物（如抗體、親和配體、適體或化學修飾物）來抑制常溫下DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR反應體系配制階段引物與模板、引物與引物之間的結合能力降低，從而避免了非特異性擴增。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動技術為在常溫下配制多個PCR反應體系提供了極大的便利，而無需犧牲PCR反應的特異性。
當反應體系配制好后，在反應初始加熱步驟，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活（圖1）。激活時間和溫度根據DNA聚合酶及熱啟動修飾物的不同而有所差別。對于某些聚合酶，激活和預變性合并成了一步。
圖1. 基于抗體熱啟動技術的DNA聚合酶
降落PCR（Touchdown PCR）
另一種提升PCR反應特異性的方法是調整PCR循環的參數。在降落PCR儀中，前幾個循環的退火溫度設定為比引物的高退火溫度（Tm）再高幾度[1,2]。較高的溫度有助于避免產生引物二聚體及非特異性引物與模板形成的復合物，因此可以減少不希望出現的擴增。就這一點來說，較高的退火溫度可減少非特異性PCR產物，在PCR起始階段促進特異性的擴增。
雖然較高的退火溫度可阻止引物二聚體形成和非特異性引物結合，但同時較高的退火溫度會加劇引物與目標序列的分離，導致PCR的產量降低。為了克服這個問題，在開始的幾個循環中，退火溫度通常設置為每個循環降低1℃，以獲得足量的預期擴增子。當退火溫度降低到溫度時（通常比低的引物Tm低3-5℃），剩余的循環都維持此退火溫度。通過這種方法，在PCR過程中，所期望的PCR產物得到有選擇性的增加，而幾乎不會出現非特異性的產物（圖2）。
圖2. 降落PCR。通過以較高的溫度起始，再隨著循環逐漸降低到退火溫度（黑色曲線），這種PCR方法可提升反應特異性（黃色曲線）。目標擴增子的產量（綠色曲線）相應的得到富集。
巢式PCR（Nested PCR）
巢式PCR是常規PCR的一種演變，其增強了反應特異性和目標擴增子的產量。在此方法中，需要設計兩對引物：一對（外引物）在目標擴增區域的側翼，而另一對引物（巢式引物）對應于所擴增DNA的準確區域。輪PCR的產物之后作為第二輪PCR的模板（圖3）。圖3. 巢式PCR
如果對引物（外引物）由于引物錯配擴增出了非特異性產物，第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低，所以通過第二對引物的擴增，PCR的特異性得到了提升。進行兩輪PCR的另一個好處是這種方法有助于從有限的起始DNA中擴增得到足量的產物。
快速PCR（Fast PCR）
在快速PCR中，通過縮減PCR步驟所需的時間來完成更快的擴增，而不影響擴增產量和效率?？焖傺h條件尤其適用于均有高擴增能力的DNA聚合酶，這種聚合酶在每次結合中可引入更多的核苷酸。高擴增能力的聚合酶可保持高擴增效率，而PCR延伸時間是Taq聚合酶（低擴增能力）延伸時間的1/2到1/3。通過將引物退火和延伸（如果溫度僅相差幾度）合并成一步，PCR反應時間可進一步縮短。這個方案也被稱為兩步PCR方案。
當使用低擴增能力的DNA聚合酶（如Taq酶）擴增<500>
另一種快速PCR的調整方法為縮短變性時間，將溫度升高到98℃。使用這種策略需要注意的是，不是高度熱穩定的聚合酶在如此高溫下容易變性。
直接PCR（Direct PCR）
直接PCR意指直接從樣本中擴增目的DNA，而無需核酸純化。直接PCR中，在高溫變性階段，諸如細胞、組織等材料在*的緩沖液中裂解，釋放出DNA。因此這種方法簡化了PCR實驗流程，減少了動手操作的時間，同時可避免純化步驟中DNA的損失：常規PCR與直接PCR對比。
推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴增。細胞碎片、蛋白、脂質和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會抑制PCR反應。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴增微量的DNA。
高GC含量PCR（GC-rich PCR）具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。高GC含量序列同時也涉及二級結構。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴增時卡住，從而影響了DNA的合成。
為了擴增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強GC相互作用，常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性，如DMSO。這些試劑通常會降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應的調整。
高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強結合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴增。高熱穩定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴增，因為更高的變性溫度（如98℃代替95℃）可促進解鏈和PCR擴增。
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